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甘草鲨烯合成酶基因的分离及植物表达载体的构建_图文

药          物 生 物 技 术

Pharmaceutical Biotechnology   2007 ,14 ( 4) :255~258

255

甘草鲨烯合成酶基因的分离及植物表达载体的构建
卢虹玉1 ,刘敬梅2 ,阳文龙2 ,高山林1
( 1. 中国药科大学 , 江苏 南京 210038 ;2. 国家作物分子设计中心 ,北京 100085)
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t hase ,SS) 基因 ,并通过酶切连接的方法构建相关植物表达载体 。结果表明 , 两个 SS 基因编码区长分别为 1242bp 、 1239bp ,分别编码 412 、 个氨基酸残基的多肽 , 与 Hayashi 等报道的光果甘草两个 SS 基因 ( GgSQS1 413 AM182330) ; 植物表达载体构建的鉴定结果表明 ,已将 GuSQS1 和 GuSQS2 序列分别正向插入到双 T2DNA 表 GuSQS2 ,为今后的次生代谢基因工程研究奠定基础 。

和 GgSQS2) 同 源 性 高 达 98 % , 分 别 命 名 为 GuSQS1 和 GuSQS2 ( GenBank 登 录 号 分 别 为 : AM182329 ,

   草 ( Gl y cy rrhi z as p. ) 是 豆 科 ( L eg um i no2 甘 s ae) 甘 草 属 植 物 , 是 我 国 重 要 的 传 统 中 草 药 。 甘草属植 物 含 有 多 种 化 学 成 分 , 其 中 被 公 认 的 有效成 分 主 要 是 三 萜 类 化 合 物 和 黄 酮 类 化 合 物 。其中三萜皂苷类化合物甘草酸 ( Glycyrrhizic acid) , 又称 甘 草 甜 素 ( Glycyrrhizin ) 具 有 抗 菌 消 炎、 镇咳 、 溃 疡 、 毒 、 病 毒 、 癌 等 生 理 活 抗 解 抗 抗 性 。现代药 理 研 究 发 现 , 甘 草 酸 及 其 水 解 产 物 甘草次酸 类 药 物 具 有 防 治 病 毒 性 肝 炎 、 血 脂 高 症 、 症 及 抑 制 SA RS 冠 状 病 毒 的 作 用 [ 1 ] 。另 癌 外甘草酸 还 是 一 种 天 然 的 甜 味 剂 , 被 广 泛 应 用 于食品工业 。 甘草酸是一种齐墩果烷型五环三 萜类 化合 物 。在甘草三萜皂苷代谢途径中 , 鲨烯是所有三 萜皂苷 、 白桦酸 、 植物激素类化合物的共同前体 , 是由鲨烯合成酶 ( Squalene synt hase ,SS) 催化两分 子的 焦 磷 酸 金 合 欢 酯 ( Farnesyl dip h osp hate , FPP) 尾尾缩合而成的 [ 2 ,3 ] ( 图 1 ) 。由 SS 催化的 该反应是植物激素和三萜皂苷生物合成特有途 径的第一步 。因此 SS 是甘草三萜类化合物生物 合成途径中的一个重要调控酶 , 可作为功能基因 应用于基因工程 , 以达到调控甘草内三萜类化合 物合成的目的 。
3 收稿日期 :2006211220     修回日期 :2007205215

作者简介 : 卢虹玉 ,女 ,1976 年 10 月 ,博士生 ,主要从事中药生物技术研究 。   3 通讯作者 : 高山林 ,教授 ,博导 。

达载体中的 CaMV 35S 启 动 子 和 NOS 终 止 子 之 间 , 重 组 质 粒 分 别 命 名 为 130/ 35S2 GuSQS1 和 130/ 35S2 关键词   乌拉尔甘草 ; 甘草酸 ; 鲨烯合成酶 ; 基因克隆 ; 双 T2DNA 表达载体 中图分类号 :Q78     文献标识码 :A     文章编号 :100528915 ( 2007) 0420255204

摘    要 采用 R T2PCR 技术从乌拉尔甘草 ( Gl ycy rrhi z a uralensis ) 中克隆甘草鲨烯合成酶 ( Squalene Syn2

Fig 1   synt hesis Pat hways of Triterpenoid in Licorice Bio

乌拉尔甘草 ( Gl ycy r rhi z a u ralensis ) 是我国西 北荒漠植被的重要植物同时又是接近濒危的大宗 地道药材 ,以其优良品质和用途广泛著称 , 还是重 要的出口商品 , 目前国家已限制对野生甘草的采 挖 ,而人工栽培乌拉尔甘草相对野生甘草有效成分 的含量较低 ,因此运用基因工程技术结合遗传育种 方法培育优良的甘草品种显得极为迫切 。本文首 次从乌拉尔甘草中克隆了甘草三萜皂苷生物合成 途径中的关键酶基因 —— — 鲨烯合成酶 ( GuSQ S) , 并构建了相应的植物表达载 130/ 35S – GuSQ S , 为甘草优良品种的培育及次生代谢产物基因工程 奠定基础 。

3

256 1  材料和方法 1. 1   材料













第 14 卷第 4 期  

Gt1 ,下游为 NOS 终止子 , 考虑到适用性 , 构建时 先将 Gt1 换成 CaMV35S 启动子 ( 来自 PB I221 质

1. 1. 1   植物材料   乌拉尔甘草种子 ( Gl y cy r rhi z a
u ralensis ) 来自内蒙 。

粒) ,再将目的基因片段插入 CaMV35S 启动子和 NOS 终止子之间 。引物设计时未带酶切位点 , 构 建时直接利用 p MD 182 T 载体自带的位点将目的 基因片段插入 130 载体中 。
3    结 果 3. 1   基因的克隆 SS

因 ,为双 T2DNA 植物表达载体 , 本室保存 ; 质粒
PB I221 ,抗性标记氨苄青霉素 Amp 。 bs 、ro mega 、 p Takara 、 上海生物工程等公司 。 2    方 法 2. 1   目的基因片段的分离及克隆 2. 0μ ,10 mmol/ l dN TPs 0. 4 μl , Taq 酶 0. 2 μl , l 10 p mol/ ml 的 两 端 引 物 各 0. 4 μl , 然 后 加 水 至 20μl 。 反应条件为 :94 ℃ 预变性 3 min ;94 ℃ 变性 30 s , 55 ℃ 退火 30 s , 72 ℃延伸 1 min , 35 个循环 ;

称取 0. 1 g 甘草叶片在液氮中研磨 ,按照试剂 盒 (上海生物工程) 说明提取甘草总 RNA , 紫外和 1 %琼脂糖电泳检测。根据 Hayashi 等[ 4 ] 发表的光 果甘草 ( Gl ycy r rhiz a glabra) 鲨烯合成酶 ( GgSQS) 基因及拟南芥、 烟草、 人参等鲨烯合成酶 ( Squalence synthase SS) mRNA 序列比对后的保守序列设计一

对引物 ,分别为 : GuSQSF :5π ATG GGG A GT TTG 2 GGA GCG AT 23π; GuSQSR : 5π CTA ( A/ g ) TT 2 AT ( C/ t ) ( t/ A) TG G ( C/ t ) G ( T/ g) TT ( A/ g) GC A G 23π ,引物由上海生物工程公司合成 。 以总 RNA 为 模 板 , Oligo ( d T) 为 引 物 , 按 照
Promega 公司逆转录酶说明书进行逆转录得到单链 PCR 扩增 ,反应体系包括 cDNA 1. 0 μ ,10 ×buffer l cDNA 。以逆转录得到的单链 cDNA 为模板进行 72 ℃ 10 min 。扩增后电泳检测分析并回收 ,回收的

目的 DNA 片段进行 TA 克隆 ,M13 双向测序引物测 序 (由上海生物工程公司完成) 。测序结果用 Blast 软件和 DNAman 软件进行序列比较分析。 2. 2   表达载体的构建 用 DNAman 软件分析目的基因的酶切位点 , 根据 p MD182 T 载体及双 T2DNA 载体 130 上所带 的内切酶位点 ,设计构建方案 。载体 130 目的基因 插入处的上游所带的是水稻胚乳特异性启动子

1. 1. 2  菌 株 和 质 粒   PMD182 T vector 购 自 HB ( 下简称 130) 载体含 Bar 筛选标记和 N P T Ⅱ 基

1. 1. 3   酶和生化试剂   购自 New England Biola2

α Takara 公司 ; 大肠杆菌 D H25 ; 质粒 130/ pL RP12

总 RNA 经反转录合成了第一条链 cDNA , 以 此链为模板 , GuSQ SF 和 GuSQ SR 为引物扩增 ,获 得大小约为 1. 2 kb 的条带 ( 图 2 ) 。回收产物经 TA 克隆筛选和测序分析得到两个长度相近但不 同的片段 ,经 Blast 和 DNAman 软件分析比对 , 结 果显示 : 两种序列片段的长度分别为 1241 bp 和 1 239 bp ,分别命名为 GuSQ S1 和 GuSQ S2 ,两者的 同源性为 88 % ( 图 3) ,分别编码 413 和 412 个氨基 酸残基组成的多肽 , 与 Hayashi 等报道的光果 甘草 的 两 个 SS 基 因 ( GgSQ S1 和 GgSQ S2 ) 序列 的 同 源 性 分 别 在 98 %以上 , 氨基酸序列 的一致性也均在 98 % 以上 。这 两 个 基 因 序

1 ,2 PCR product of SS

列已经提交 GenBank , 3 marker 登 录 号 为 : GuSQ S1 : Fig 2  Gel elect rop herogram of PCR p roduct of SS AM182329 ; GuSQ S2 : AM182330 。 3. 2   植物表达载体的构建及结构

3. 2. 1   s 启动子的插入   35 为了把 130 载体上的 Gt1 启动 子 换 成 组 成 型 的 35 s 启 动 子 , 分 别 用 Hind Ⅲ Bam H Ⅰ双酶切 PB I221 质粒和 130 质 和

粒 ,分别回收前者的 CaMV35S 小片段和后者的大 α 片段连接 , 转化大肠杆菌 D H25 , 得到重组质粒 , ( 图 4 ) 。酶切法鉴定显 此中间载体命名为 130/ 35S 示 35S 启动子已插入 130 载体中 ( 图 5) 。  
3. 2. 2  GuSQ S1 和 GuSQ S2 片段的插入   通过对 GuSQ S1 和 GuSQ S2 基因片段的酶切位点分析及 T 载体上为正向插入 ,命名为 PMD 182 GuSQ S1 ,内

酶切后的电泳检测显示 , GuSQ S1 片段在 p MD 182 部不含 Xba Ⅰ 位点 ; GuSQS2 片段为反向插入 ,不

卢虹玉等 : 甘草鲨烯合成酶基因的分离及植物表达载体的构建

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Fig 3  The nuleotide sequences adn co mpariso n of two SS of G , uralensis

Fig 5  Identificatio n of reco mbinant 130/ 35S

SmaⅠ KpnⅠ 和 完全酶切后回收的大片段连接 ,得到的

Fig 4  Go nst ructio n of 130/ 35S vecto r

含 Kp n Ⅰ位点 , 命名为 PMD 182 GuSQ S2 , 两者均 含 HincⅡ 位点。XbaⅠ SmaⅠ 和 完全酶切 130/ 35S 质 粒 ,回收大片段。先用 XbaⅠ PMD182 GuSQS1 线 将 性化 ,再经 Hinc Ⅱ 不完全酶切 , 回收 1200bp 左右的 α 片段 ,和 130/ 35S 大片段连接转化大肠杆菌 D H25 , 得到重组表达载体 ,命名为 130/ 35S2 GuSQS1 ,酶切 鉴定表明片段已插入表达载体 ( 图 6) 。以 KpnⅠ 将 酶切 ,回收 1200bp 左右的片段 ,与 130/ 35S 质粒经
PMD 182 GuSQS2 完全线性化后 ,再经 HincⅡ 不完全

重组表达载体命名 130/ 35S2 GuSQS2 ,酶切结果显 示已成功插入 (图 6) 。
1 ,2 130/ 35S2 GuSQS1 3 ,4 130/ 35S2 GuSQS2

Fig 6   Identification of reco mbinant s 130/ 35S2 GuSQSland 130/ 35S2 GuSQS2

258 4    讨 论













第 14 卷第 4 期  

甘草酸是甘草产生的独特三萜类天然产物 ,鲨 烯是经甲羟戊酸 ( mevalo nic acid ,MVA ) 途径生成 的两个 FPP 缩合而成的 ,而 FPP 是倍半萜类和三 萜类的共同前体[ 2 ] , 必然存在底物竞争关系 , 因此 SS 催化鲨烯合成的这步反应是三萜类合成途径中 的第一个重要调控步骤。目前已在多种植物中克隆 并鉴定了 SS 基因 ,包括人参 、 烟草、 拟南芥、 苜蓿等。 本文利用简并引物同时分离到两个 GuSQS 基因 ,序 列分析结果表明 ,这两个序列与 Hayashi 等报道的 SQS 序列同源性为 98 %以上 ,和 GenBank 中植物来 源的 SS 基因同源 , 与烟草 、 拟南芥、 人参等植物的 SS 基因序列同源性在 87 %以上 ,均属于三萜类和植 物激素类化合物来源的甲戊二羟酸 ( mevalonic acid , MVA ) 途径中的重要调控酶 —— — 鲨烯合成酶 ( SS) 家 族 ,且有研究表明 ,SS 表达的提高能相应的增强其 下游催化酶基因的表达[ 5 ,6 ] 。 药用植物功能基因的克隆和基因工程在一些 需求大 、 来源少的药用植物如青蒿 、 红豆杉 、 紫草等 方面取得了令人鼓舞的进展 。通过对甘草功能基 因的克隆和基因工程方法缓解甘草资源问题 。为 了避免抗性标记可能带来的危害 , 构建了 双 T2 DNA 的重组植物表达载体 130/ 35S2 GuSQ S , 期望

日后通过对转基因植株种子的筛选分离到无抗性 标记的种子 ,用于产业化种植或其他收获甘草酸的 生产 。
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Abstract  Two squalene synt hase ( SS ) genes were clo ned f ro m Gl y cy r rhi z a u ralensis using R T2PCR met hod and co nst ructed t heir exp ressio n vecto rs by rest rictio n endo nucleases and ligases. The result s showed t hat t wo GuSQ S were 1142bp and 1139bp in lengt h encoding two pelypeptides of 413 and 412 a2 mino acids respectively sharing 98 % identit y to two SS cDNA f ro m Gl y cy r rhi z a gl abra reported by Ha2 yashi and were named as GgSQ S1and GgSQ S2 ( GenBank Accessio n number : AM182329 , AM182330) , respectively. A nalysis of co nst ructio ns verified t hat GgSQ S1and GgSQ S2 were inserted bet ween CaMV35S p ro moter and NOS terminator in do uble T2DNA exp ressio n vector. Two reco mbinant s gained were designated as 130/ 35S2 GuSQ S1 and 130/ 35S2 GuSQ S2 , respectively , which wo uld lay a fo undatio n for st udying gene engineering of seco ndary metabolism in f ut ure. Key words  Gl ycy r rhi z a u ralensis , Glycyrrhizic acid , Squalene synt hase Gene clo ning , Do uble T2DNA exp ressio n vector

L U Ho ng2yu1 , L IU J ing2mei2 , YAN G Wen2lo ng2 , GAO Shan2lin1

Isolation of Squalene Synthase Genes of Gl ycyr r hiza Ur alensis and Construction of Plant Expression Vector
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Phy tochemist ry .




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