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食用菌栽培与加工02菌种扩大培养_图文

第二章 发酵的流程 菌种扩大培养

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第一节 发酵的特点及流程
一、发酵的特点 发酵和其他化学工业的最大区别在于它是生物体所进行的化 学反应。其主要特点如下:
1、发酵过程一般来说都是在常温常压下进行的生物化学 反应,反应安全,要求条件也比较简单。
2、发酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他农副产品为 主,只要加入少量的有机和无机氮源就可进行反应。微生物因 不同的类别可以有选择地去利用它所需要的营养。基于这—特 性,可以利用废水和废物等作为发酵的原料进行生物资源的改 造和更新。

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3、发酵过程是通过生物体的自动调节方式来完成的,反应 的专一性强,因而可以得到较为单—的代谢产物。
4、由于生物体本身所具有的反应机制,能够专一性地和高 度选择性地对某些较为复杂的化合物进行特定部位地氧化、还 原等化学转化反应,也可以产生比较复杂的高分子化合物。
5、发酵过程中对杂菌污染的防治至关重要。除了必须对设 备进行严格消毒处理和空气过滤外,反应必须在无菌条件下进 行。如果污染了杂菌,生产上就要遭到巨大的经济损失,要是 感染了噬菌体,对发酵就会造成更大的危害。因而维持无菌条 件是发酵成败的关键。
6、微生物菌种是进行发酵的根本因素,通过变异和菌种筛 选,可以获得高产的优良菌株并使生产设备得到充分利用,也 可以因此获得按常规方法难以生产的产品。

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7、工业发酵与其他工业相比,投资少,见效快,可以取得显著 的经济效益。
基于以上特点,工业发酵日益引起人们重视。和传统的发 酵工艺相比,现代发酵工程除了上述的发酵特征之外更有其优 越性。除了使用微生物外,还可以用动植物细胞和酶,也可以 用人工构建的“工程菌’来进行反应;反应设备也不只是常规 的发酵罐,而是以各种各样的生物反应器而代之,自动化连续 化程度高,使发酵水平在原有基础上有所提高和和创新。

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二、发酵过程的组成部分
1、发酵过程的组成 除某些转化过程外,典型的发酵过程可以划分成六个基 本组成部分: (1)繁殖种子和发酵生产所用的培养基组份设定; (2)培养基、发酵罐及其附属设备的灭菌; (3)培养有活性、适量的纯种,接种入生产容器中; (4)微生物在最适合于产物生长的条件下,在发酵罐 中生长; (5)产物萃取和精制; (6)过程中排出的废弃物的处理。 六个部分之间的关系如图所示。在建立发酵过程以前, 首先要分离出产生菌,并改良菌种,使所产生的产物符合 工业要求。

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3、发酵生产的条件
(1)某种适宜的微生物 (2)保证或控制微生物进行代谢的各种条件(培 养基组成,温度,溶氧pH等) (3)进行微生物发酵的设备 (4)提取菌体或代谢产物,精制成产品的方法和 设备

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第二节 生产菌种的扩大培养
发酵罐容积几百立方米。 生产用种子是一个由实验室制备到车间生产的过程。 其生产方法与条件随不同的生产品种和菌种种类而异。 如细菌、酵母菌、放线菌或霉菌生长的快慢;产孢子能 力的大小;营养、温度、需氧等条件要求均有所不同。 种子扩大培养应根据菌种的生理特性,选择合适的培 养条件来获得代谢旺盛、数量足够的种子。种子接入发 酵罐后,将使发酵生产周期缩短,设备利用率提高。种 子液质量的优劣对发酵生产起着关键性的作用。

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种子扩大培养:是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休
眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后,在经过扁瓶或摇瓶及 种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些 纯种培养物称为种子。
发酵工业生产过程中的种子的必须满足以下条件: (1)菌种细胞的生长活力强,移种至发酵罐后能迅速生长, 迟缓期短; (2)生理性状稳定; (3)菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求; (4)无杂菌污染; (5)保持稳定的生产能力。

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在发酵生产过程中,种子制备的过程大致可分为两个阶段: (1)实验室种子制备阶段
(2)生产车间种子制备阶段

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一、实验室种子的制备 实验室种子的制备一般采用两种方式:
产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用 固体培养基培养孢子,孢子可直接作为种子罐的种子,这样 操作简便,不易污染杂菌。
产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种,可用液体培养法。

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(一)孢子的制备
1、细菌孢子的制备 细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富。
培养温度一般为37℃。细菌菌体培养时间1~2d,产芽孢的 细菌培养5~10d。
2、霉菌孢子的制备 霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等 天然农产品为培养基。培养的温度一般为25~28℃。培养时 间一般为4~14d。 3、放线菌孢子的制备 放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基,培养基中含
有适合产孢子的营养成分,如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和无 机盐等。培养温度一般为28℃。培养时间5~14d。

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(二)液体种子制备 1、好氧培养 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种,如产链霉素的灰 色链霉菌(S. griseus)可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含 液体培养基的摇瓶中,恒温振荡培养,获得菌丝体,作为种子 。其过程如下:
试管→三角瓶→摇床→种子罐 2、厌氧培养 酵母菌(啤酒,葡萄酒,清酒等)其种子的制备过程如下: 试管→三角瓶→卡式罐→种子罐

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例如:
生产啤酒的酵母菌一般保存在麦芽汁琼脂或MYPG培养基 (培养基配制:3g麦芽浸出物,3g酵母浸出物,5g蛋白胨,10g 葡萄糖和20g琼脂于1L水中)的斜面上,于4℃冰箱内保藏。每 年移种3-4次。
将保存的酵母菌种接入含10ml麦芽汁的500-1000ml三角瓶中, 再于25℃培养2-3d。
再扩大至含有250-500ml麦芽汁的500-1000ml三角瓶中,再 于25℃培养2d.
移种至含有5-10L麦芽汁的卡氏培养罐中,于15-20℃培养35d即可作100L麦芽汁的发酵罐种子。从三角瓶到卡氏培养罐培
养期间,均需定时摇动或通气,使酵母菌液与空气接触,以有 利与酵母菌的增殖。

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二、生产车间种子制备
种子罐的培养基因不同菌种而异,但其原则为采用易被菌 利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等,
需氧菌,还需供给足够的无菌空气,并不断搅拌,使菌( 丝)体在培养液中均匀分布。
1、种子罐的作用 使孢子发芽,生长繁殖成菌(丝)体,接入发酵罐能迅速 生长,达到一定的菌体量,以利于产物的合成。 2、种子罐级数的确定 种子罐级数:是指制备种子需逐级扩大培养的次数,取决 于: (1)菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度; (2)所采用发酵罐的容积。

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比如: 细菌:生长快,种子用量比例少,级数也较少,二级发酵。
茄子瓶→种子罐→发酵罐 霉菌:生长较慢,如青霉菌,三级发酵
孢子悬浮液→一级种子罐(27℃,40h孢子发芽,产生菌丝 )→二级种子罐(27℃,10~24h,菌体迅速繁殖,粗壮菌丝体 )→发酵罐
放线菌:生长更慢,采用四级发酵 酵母:比细菌慢,比霉菌,放线菌快,通常用一级种子

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3、确定种子罐级数需注意的问题 (1)种子级数越少越好,可简化工艺和控制,减少染菌机会 (2)种子级数太少,接种量小,发酵时间延长,降低发酵罐 的生产率,增加染菌机会 (3)虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与 所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件,加速了孢子 发芽及菌体的繁殖,也可相应地减少种子罐的级数。

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第三节 种子质量的控制 一、影响孢子质量的因素及控制
影响孢子质量的因素通常有:培养基、培养条件、培养时间 和冷藏时间等。
1、培养基 种子质量不稳定的主要原因是原材料质量波动。
例如:在四环素、土霉素生产中,配制产孢子斜面培养基用 的麸皮,因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质 量的影响也不同。
蛋白胨加工原料不同如鱼胨或骨胨对孢子影响不同。 原材料质量的波动,也会影响孢子质量。如微量元素Mg2+ 、 Cu2+ 、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也会影响孢 子的质量。

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水质的影响:地区不同、季节变化和水源污染,均可造 成水质波动,影响种子质量。
菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落,氮 源品种越多,出现的菌落类型也越多,不利于生产的稳定。
解决措施: (1)培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使用; (2)严格控制灭菌后培养基的质量; (3)斜面培养基使用前,需在适当温度下放置一定时间; (4)供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源,作为选 种或分离用的培养基则采用较复杂的有机氮源。

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2、培养条件 (1)温度 如土霉素生产菌种在高于37℃培养时,孢子接入发酵罐后出 现糖代谢变慢,氨基氮回升提前,菌丝过早自溶,效价降低等 现象。一般要严格控制孢子子斜面的培养温度。 (2)湿度 制备斜面孢子培养基的湿度对孢子数量和质量有较大影响。
例如土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子制备时发现:气候干燥 地区孢子斜面长得较快,在含有少量水分的试管斜面培养基下 部孢子长得较好,斜面上部由于水分迅速蒸发呈干疤状,孢子 稀少。
在气温高含湿度大的地区,斜面孢子长得慢,主要由于试管 下部冷凝水多而不利于孢子的形成。

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表2-1 不同相对湿度对龟裂链霉菌斜面生长的影响

相对湿度 (%)
16.5~19 25~36 40~45

斜面外观
上部稀薄下部稠略黄 上部薄中部均匀发白 一片白,孢子丰富, 稍皱

活孢子计数 (亿/支)
1.2 2.3 5.7

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3、培养时间和冷藏时间 (1)培养时间 一般来说,衰老的孢子不如年轻的孢子,因为衰老的孢子已 在逐步进入发芽阶段,核物质趋于分化状态。过于衰老的孢子 会导致生产能力的下降。 解决措施:
孢子培养的时间应该控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量 正常的阶段终止培养。
(2)冷藏时间 斜面冷藏对孢子质量影响与孢子成熟程度有关。如土霉素生 产菌种孢子斜面培养4d左右即于4℃冰箱保存,发现冷藏7~8d菌 体细胞开始自溶。而培养5d以后冷藏,20d未发现自溶。

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冷藏时间对孢子生产能力也有影响。例如在链霉素生产中, 斜面孢子在6℃冷藏两个月后发酵单位比冷藏一个月降低18%, 冷藏3个月后降低35%。
4、接种量 接种量大小影响到培养基中孢子的数量,进而影响菌体
的生理状况。也影响到菌种的适应期。

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二、影响种子质量的因素及控制
生产过程中影响种子质量的因素通常有:孢子的质量、培养 基、培养条件、种龄、接种量。
1、培养基 种子培养基要满足以下要求:
(1)营养成分适合种子培养的需要 (2)选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基; (3)营养上要易于被菌体直接吸收和利用; (4)营养成分要适当丰富和完全,氮源和维生素含量要高 (5)营养成分要尽可能与发酵培养基相近。

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2、培养条件 (1)温度 (2)通气量 在种子罐中培养的种子除保证供给易被利用的培养基外,有
足够的通气量可以提高种子质量。例如,青霉素的生产菌种在
制备过程中将通气充足和不足两种情况下得到的种子分别接入 发酵罐内,它们的发酵单位可相差1倍。但也有例外,例如土霉 素生产菌,一级种子罐的通气量小对发酵有利。

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3、种龄 种龄:是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。 通常种龄是以处于生命力极旺盛的对数生长期,菌体量还未达到最大值时的培养时 间较为合适。时间太长,菌种趋于老化,生产能力下降,菌体自溶;种龄太短,造成 发酵前期生长缓慢。
不同菌种或同一菌种工艺条件不同,种龄是不一样的,一般需经过多种实验来 确定。如嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶,12小时最好(见下图)。

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4、接种量 接种量:是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。
接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度,采用较大的接种量可 以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间,使产物的形成提前到来,并可减少杂菌 的生长机会。但接种量过大或者过小,均会影响发酵。过大会引起溶氧不足,影响 产物合成;而且会过多移入代谢废物,也不经济;过小会延长培养时间,降低发酵 罐的生产率。通常接种量,细菌1~5%,酵母菌5~10%,霉菌7~15%,有时20~25%

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三、种子质量的控制措施
种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的生产 能力。因此首先必须保证生产菌种的稳定性,其次是提供种子 培养的适宜环境保证无杂菌侵入,以获得优良种子。因此在生 产过程中通常进行以下两项检查。
(1)菌种稳定性的检查 (2)无(杂菌)检查

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四、种子质量标准 1、细胞或菌体 菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观(色素、颗粒等)
单细胞:菌体健壮、菌形一致、均匀整齐,有的还要求有一 定的排列或形态;
霉菌、放线菌:菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛 、菌丝分枝情况和内含物情况好。
2、生化指标 种子液的糖、氮、磷的含量和pH变化。

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3、产物生成量 在抗生素发酵中,产物生成量是考察种子质量的重要指标,因 为种子液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程 度。 4、酶活力 种子液中某种酶的活力,与目的产物的产量有一定的关联。

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五、种子异常分析 菌种生长速度,过快或过慢 菌丝结团 菌丝粘壁 感染噬菌体

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第四节 实例
一、谷氨酸发酵的菌种扩大培养
斜面菌种→一级种子培养→二级种子培养→发酵罐 1、斜面菌种的培养 菌种的斜面培养必须有利于菌种生长而不产酸,并要求斜面
菌种绝对纯,不得混有任何杂菌和噬菌体,培养条件应有利于 菌种繁殖,培养基以多含有机氮而不含或少含糖为原则。
(1)斜面培养基组成 葡萄糖 0.1%,蛋白胨 1.0%,牛肉膏 1.0%,氯化钠 0.5%,琼 脂 2.0~2.5%,pH 7.0~7.2(传代和保藏斜面不加葡萄糖)。 (2)培养条件 33~34℃,培养18~24h。

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2、一级种子培养 一级种子培养的目的在于大量繁殖活力强的菌体,培养基组
成应以少含糖分,多含有机氮为主,培养条件从有利于长菌考 虑。
(1)培养基组成 葡萄糖 2.5%,尿素 0.5%,硫酸镁 0.04%,磷酸氢二钾 0.1% ,玉米浆 2.5~3.5%(按质增减),硫酸亚铁、硫酸锰各2ppm, pH7.0。 (2)培养条件 用1000mL三角瓶装入培养基200mI,灭菌后置于冲程7.6cm、 频率96次/min的往复式摇床上振荡培养12h,培养温度33~34℃ 。

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(3)一级种子质量要求 种龄:12h,pH值:6.4±0.1 光密度:净增OD值0.5以上 残糖:0.5%以下 无菌检查:(-) 噬菌体检查:(-) 镜检:菌体生长均匀、粗壮,排列整齐
革兰氏阳性反应。

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3、二级种子培养 为了获得发酵所需要的足够数量的菌体,在一级种子培养的 基础上进而扩大到种子罐的二级种子培养。种子罐容积大小取 决于发酵罐大小和种量比例。 (1)培养基组成

培养基组成 T6-13

B9

T738

AS1.2

(%)

99

水解糖

2.5

2.5

2.5

2.5

玉米浆

2.5-

2.5-

2.5-

2.5

磷酸氢二钾 硫酸镁

3.5 0.15 0.04

3.5 0.15 0.04

3.5 0.2 0.05

0.1 0.04 0.5

尿素

0.4

0.4

0.5

2

Fe++(ppm)

2

2

2

2

Mn++(ppm)

2

2

2

6.5-

pH

6.8-

6.8-

7.0

6.8

7.0

7.0

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(2)培养条件 接种量:0.8~1.0% 培养温度:32~34℃ 培养时间:7~8h 通风量:
50L种子罐1:0.5 搅拌转速340r/min; 250L种子罐1:0.3 搅拌转速300r/ min 500L种子罐1:0.25 搅拌转速230r/ min

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(3)二级种子的质量要求 种龄:7~8h pH:7.2左右 OD值净增0.5左右 无菌检查(-) 噬菌体检查(-)

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二、啤酒酵母的扩大培养
一般可采用三级扩大培养,扩大倍数:第1级到第2级为8-10 倍,第2级到第3级为4-6倍。
1、实验室扩大培养

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第五节 生产发酵罐的无菌接种
生产规模发酵罐的接种,包括两个方面:从实验室摇瓶或 孢子悬浮液容器中移种入一个种子罐;从一个种子罐移入另 一个生产发酵罐中。
(1)从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器接种 通常有两种方式

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第四节 菌种的保藏与复壮 一、菌种的保藏 1、菌种保藏的意义
菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料,特别
是利用微生物进行有关生产如抗生素、氨基酸、酿造等工业, 更离不开菌种。所以菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育 种工作的重要组成部分。
其任务首先是使菌种不致死亡,同时还要尽可能设法把菌 种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。
常用的要求:低温、隔氧、干燥

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2、菌种保藏的目的 菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点人工创造条件使 孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低,以减少其变异。一般 可通过保持培养基营养成分在最低水平缺氧状态,干燥和低 温,使菌种处于“休眠”状态,抑制其繁殖能力。
一种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优良性状 不变,同时还需考虑到方法本身的简便和经济,以便生产上 能推广使用。

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3、菌种保藏的方法 (1)斜面低温保藏法

将菌株接种于合适斜面培养基上,待生长好后置于4冰

箱保藏,每隔一定时间进行移接培养后再将新斜面继续保

藏。

这种保藏方法简单,存活率高,易于推广,经常使用的

菌种可采用这种方法。其缺点是菌种仍有一定强度的代谢

活动条件,保存时间不长,而且传代多,因此菌种客易产

生变异。

(2)石蜡油封保藏法

将生长好的新鲜斜面在无菌条件下倒入已灭菌的液体石

蜡,油层要高出斜面上端1cm,使之与空气隔绝,然后垂

直放于室温或冰箱内保藏即可。

这种方法也比较简便,且保藏时间一般可长达l年以上

。适于保存部分霉菌、酵母菌、放线菌,但对细菌效果较

差,对某些能同化烃类的微生物则不适用。

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(3)砂土管保藏法

将孢子悬浮液转移至灭过菌的砂土管中,于真空干燥器内用

真空泵抽干,再转至有干燥剂的容器中,密封低温保藏。本方

法是用人工方法模拟自然环境使菌种得以栖息。适用于细菌的

芽孢、霉菌和放线菌孢子的保藏,不适于对干燥敏感的无芽孢

的细菌和酵母菌。主要包括砂土制备和真空抽干两步。

(4)冷冻干燥法

此法的原理是在低温下迅速将细胞冻结以保持细胞结构的完

整,然后在真空下使水分升华。这样菌种的生长和代谢活动处

于极低水平,不易发生变异和死亡,因而能长期保存,一般为

5~10年。微生物在此条件下易死亡,所以需加入一些物质作保

护剂,一般常用的是脱脂牛奶、血清等。该法存活率高,变异

率低,并能广泛适用于细菌(有芽孢和无芽孢的)、酵母、霉

菌孢子、放线菌孢子和病毒等,因此是目前广泛采用的好方法

。其缺点是手续麻烦,操作复杂,要求严格,并需有一定设备

条件。

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(5)超低温保藏法 由于现在超低温冰箱的使用已较普及,所以菌种的超低温
保藏法在生产企业和研究机构已得到广泛应用。该方法的要 点是:将要保藏的菌种置于10%甘油或二甲基亚砜保护剂中 ,密封于试管或安瓿管中,然后将其放入超低温冰箱中于70℃下保藏。该法简便易行,而且保藏效果较好。

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二、发酵工业微生物菌种的衰退与复壮 微生物具有生命活动能力,其世代时间一般是很短的,在
传代过程中易发生变异甚至死亡,因此常常造成工业生产菌 种的退化,并有可能使优良菌种丢失,所以,如何保持菌种 优良性状的稳定是研究菌种保藏的重要课题。

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(一)微生物菌种的衰退

菌种退化是指在较长时期传代保藏后,菌株的一个或多

个生理性状和形态特征逐渐减退或消失的现象。

常见的菌种衰退在形态上表现为分生孢子的减少或菌落

颜色的改变。在生理上常指菌种发酵能力的降低,有些菌

的抗噬菌体能力下降。对诱变育种而获得的高产变异株则

常表现出恢复野生型性状等。

菌种的真正退化必须与由于环境原因变化而引起菌种形

态、和生理上的变异区别开来。如培养基中微量元素缺乏

会导致孢子数量减少,也会引起孢子颜色的改变。此外,

温度、pH、不同碳氮源都会导致菌种变化。但只要一旦恢

复正常条件,这些现象就会消失。

杂菌污染也会造成菌种退化的假象。因此,必须正确判

断是否退化,才能找出正确的解决办法。一般菌种退化是

从量变到质变逐渐发生的,同时也是整个群体中产量降低

及其相联系的种种特性的变化,而不是指单个细胞的改变

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引起菌种退化的原因主要有: 1、基因突变 菌种退化的主要原因是有关基因的负突变。如果控制产量的 基因发生负突变则会引起产量下降,如果控制孢子生成的基因 发生负突变则孢子性能就会下降。当然,这些负突变都是自发 形成的。经常处于旺盛生长状态的细胞比休眠状态细胞发生突 变的机率大得多。在发酵生产中常用营养缺陷型突变株,如缺 陷型发生回复突变就会使产量水平下降。
如粘质赛氏杆菌(Serratia marcescens)H-2892菌株生产力为 18g/L组氨酸,经5次传代后因回复突变型增多,产量下降至 4g/L。很多抗生素生物合成、产生气生菌丝和色素等性状都部 分或全部受质粒基因控制。当菌株连续传代、菌体发生质粒脱 落而出现大量光秃型菌落,则生产能力也显著下降。

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2、变异菌株性状分离 变异菌株性状分离也会引起高产性状的丧失。在菌种筛选工 作中初筛摇瓶产量很高,复筛产量逐渐下降而被淘汰的现象, 在霉菌中更为常见。
当诱变的单菌落是由一个以上孢子或细胞形成,而其中只有 一个孢子或细胞是高产时,在移接传代过程中,这个高产菌株 数量减少,当然产量也就下降。
菌落是由一个孢子或单个细胞形成,只要它是多核细胞,
在诱发突变中核的变化不会都一样,随着菌种传代和核的分离 也会使性状表现多样化,产量也会随之变化。

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单核孢子发生突变时,如果双链DNA上仅一条链上某个 位点发生变化,经移殖后也会出现性状分离。因此一个较 稳定的变异株的获得必须经过多次分离纯化。为了得到较 多纯种,有人考虑提高诱变剂量,使单核细胞DNA双链中 一条链的某一点发生突变,另一条链完全失活不再复制来 提高纯菌产生率。
3、连续传代 连续传代也是菌种退化的直接原因。个别细胞性状改变 不足以引起菌种退化,经多次传代,退化细胞在数量上占 优势,于是退化性状表现逐步明朗化,最终成为一株退化 菌株。

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4、其它因素 其它如温度、湿度、培养基成分及各种培养条件都会引起菌种的基因突
变。例在保藏菌种中基因突变率就随温度降低而减少,又例在产腺苷的黄 膘吟缺陷型中,若在培养基中加入黄嘌呤、鸟嘌呤及组氨酸和苏氨酸可降 低回复突变的数量。
(二)防止菌种衰退和退化菌种的复壮 1、防止菌种衰退 防止菌种衰退的方法有: (1)控制传代次数 基因的变化往往发生在复制和繁殖过程中,繁殖越颇繁,复制的次数越 多,基因发生变化的机会也就越多。因此应该尽量避免不必要的接种和传 代,把传代次数控制在最低水平,以降低突变机率。一般情况下,斜面每 移植一代,霉菌、放线菌、芽孢杆菌在低温下可保藏半年左右,酵母可保 藏3个月左右,无芽孢细菌可保藏1个月左右。为此,生产菌种每移植一代 ,最好同时移植较多的斜面,以供一段时间生产之需,这样移植次数就可 减少。

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(2)选择合适的培养条件 培养条件对菌种衰退有一定的影响,选择一个适合原种生长 的条件可以防止菌种衰退。另外,生产上应避免使用陈旧的斜 面菌种。 (3)利用不同类型的细胞进行传代 在放线菌和霉菌中,由于它们的菌丝细胞常含有许多核,甚 至是异核体,因此用菌丝接种时就会出现衰退和不纯的子代。 而孢子一般是单核的,利用孢子来接种,可以达到防止衰退的 目的。但是这也必须注意到微生物细胞本身的特点。对构巢曲 霉来说,利用它的分生孢子传代易发生衰退而用它的子囊孢子 移种则不易退化。

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(4)选择合适的保藏方法 采用有效的菌种保藏方法也可以防止菌种的衰退。
由于菌种衰退的情况不同,对有些衰退原因还不甚了解,因 此要切实解决具体问题,需根据实际情况,通过实验正确地加 以运用。
2、退化菌种的复壮 使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性,称为复壮。常用的 方法是对已退化菌株用一定培养条件进行单细胞分离纯化。从 而限制退化菌株在数量上占优势,最后淘汰已退化菌落而使原 菌株得得以复壮。例如用高剂量UV或再配以低剂量NTG对退化 菌株进行处理,可得到较多的纯菌落,又如选择一种对退化型 菌株细胞核具有更大杀伤力的诱变剂亦可使原菌株得到复壮。 但这工作量不亚于新突变株的诱变育种,另外,用遗传方法选 育不易退化的稳定菌株或采用双缺、三缺菌株及减少传代次数 等方法,都可防止菌种退化,保存稳定菌株。

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